研究簡介：肺表面活性劑（PS）是一種復雜的脂質/蛋白質混合物，覆蓋在肺泡的空氣-液體界面上，主要功能是降低表面張力，防止肺泡在呼氣末塌陷。PS的生物物理功能依賴于其獨特的成分，其中主要成分是二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酰膽堿（DPPC），還包含其他磷脂、膽固醇以及特定的蛋白質，特別是疏水蛋白SP-B和SP-C。SP-B和SP-C雖然在PS中的總質量占比不到1%，但對PS的生物物理功能至關重要。然而SP-B和SP-C在PS三維結構形成中的具體作用機制尚不清楚。其功能依賴于在肺泡界面形成并維持一個復雜的單層膜及與之相連的亞表面多層膜（即“儲備庫”）系統(tǒng)，該3D結構能夠在呼吸周期中實現脂質的快速交換與補充。然而這一關鍵3D結構形成的具體蛋白驅動機制尚不明確。

研究者使用了多種實驗技術，包括中子反射（NR）、表面壓力-面積（Π-A）等溫線、橢偏光測量和表皮熒光顯微鏡，來研究PS膜和薄膜在不同壓縮階段的結構。實驗中使用了由DPPC、棕櫚酰油?；?sn-甘油-3-磷酰膽堿（POPC）和棕櫚酰油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰甘油（POPG）組成的模型PS膜，并在其中添加了10%的SP-B或SP-C。研究結果表明，SP-B在PS膜的三維結構形成中起著關鍵作用，能夠穩(wěn)定界面并促進脂質儲庫的形成。而SP-C雖然在脂質交換中發(fā)揮作用，但需要SP-B的存在才能整合到界面結構中。這些發(fā)現為理解PS在呼吸過程中的動態(tài)行為提供了重要的結構基礎，并為設計新一代優(yōu)化的臨床PS制劑提供了理論依據。

Kibron LB膜分析儀的的應用

Kibron LB膜分析儀用于在受控條件下制備、壓縮和分析氣-液界面上的肺表面活性物質模型膜，并與其他分析技術聯用。實驗前，LB槽體需用氯仿和超純水仔細清潔，然后注入170 mL的Tris-NaCl緩沖液（pH 7.4)。將溶解在氯仿/甲醇（2:1,v/v）中的脂質或脂質/蛋白質混合溶液，使用漢密爾頓微量注射器鋪展在空氣-水界面上。在開始壓縮前，預留15分鐘讓溶劑完全蒸發(fā)。壓縮過程的速率控制在8.8 cm2?min?1。亞相溫度通過循環(huán)水浴維持在22.0±0.1°C。表面壓力通過使用濾紙制成的Wilhelmy吊片法壓力傳感器進行記錄。

LB膜分析儀可獲取表面壓力-面積（Π-A）等溫線，直接用于測量模型單層膜（純脂質、脂質+SP-B、脂質+SP-C）的壓縮Π-A等溫線。等溫線顯示，所有系統(tǒng)在壓縮至約40 mN/m時均出現一個明顯的平臺區(qū)，這對應于單層膜從二維向三維結構的轉變（buckling-dominated collapse），模擬了生理呼氣末期的膜重組過程。通過計算平臺區(qū)壓縮面積占總面積的百分比（%Aplateau），研究人員量化了SP-B和SP-C在穩(wěn)定三維結構能力上的差異。結果表明SP-B系統(tǒng)的%Aplateau（35%）顯著高于SP-C系統(tǒng)（27%）和純脂質系統(tǒng)（18%），直接證明了SP-B在促進和穩(wěn)定膜儲備庫形成方面具有更強大的能力。與橢圓偏振測量聯用，研究中，將Beaglehole Picometer Light Ellipsometer與Kibron G2槽聯用，實時監(jiān)測壓縮過程中光學參數d△的變化。

實驗結果

提出的結果清楚地證明了蛋白質SP-B在壓縮下成核和穩(wěn)定3D界面多層儲層的關鍵作用，而SP-C的作用似乎是輔助的——促進脂質交換，但需要SP-B來結構整合到界面結構中。從表面循環(huán)前后的中子反射法的可比剖面推斷出，這些SP-B促進的儲層一旦受到類似呼吸的壓縮-膨脹動力學，就會與界面穩(wěn)定地結合。然后SP-B被證實是維持肺泡空間PS薄膜復雜結構的關鍵分子。本工作連接了早期的分子模擬和生理學研究，為SP-B獨特的界面重塑能力提供了直接的實驗證據，這與之前關于SP-B對呼吸和生命至關重要的知識一致。未來結合氘代蛋白、生理脂質混合物和全組合蛋白質補體的工作將完善對PS動力學的理解，對設計新一代優(yōu)化的臨床PS制劑以治療尚未解決的表面活性劑缺乏性肺部疾病產生影響。

圖1、實驗方法的示意圖總結。A)將肽溶液制備成DMF。B)在空氣-水界面處沉積并使用LB裝置進行壓縮。C)轉移到云母基材上。D)用金屬鹽選擇性浸漬并用UV/O3去除肽。

圖2、A)FP1和FP2肽的化學結構。FP1（B和D）和FP2（C和E）肽LB膜的AFM顯微照片分別在無壓縮（B和C）和20 mN m-1（D和E）的情況下轉移到新鮮切割的云母基底上。F,G)導致纖維形成的肽β-折疊二級結構的示意圖。H)在這項工作中研究的樣品的LDIR光譜。I)將酰胺I帶解卷積為其主要成分。

圖3、A)在空氣/水界面上鋪展的FP2肽的壓縮等溫線π–A以及在3、10、20和30 mN m?1下獲得的LB肽膜的AFM顯微照片（分別為B、C、D和E））。

圖4、A)用于擬合NR數據的模型示意圖。B)10、C)20和D)30 mN m-1處界面的密度分布。E）通過NR獲得的纖維的總厚度。F)界面剪切流變測量。G)通過分析AFM圖像獲得纖維的間距和曲率。

圖5、從35 mN/m處的擬合獲得的結構參數分別表示每層的厚度和水體積分數。ΔSLD（%）表示擬合SLD與理論SLD值之間的百分比差。

總結

自發(fā)現以來，破譯呼吸氣液界面處肺表面活性劑（PS）的分子結構一直是一項重大挑戰(zhàn)。這在呼氣結束時的最小肺容積和表面積下尤為重要，此時PS會迅速重組為3D膜網絡而不會與界面膜分離，從而確保后續(xù)呼吸周期的準備和穩(wěn)定性。研究人員利用中子反射法和落射熒光顯微鏡在專門設計的表面天平中，研究了模型PS膜和薄膜在不同壓縮階段的結構，重點關注疏水表面活性劑蛋白SP-B和SP-C在界面系統(tǒng)組織中的關鍵作用。所研究的模型表面活性劑薄膜的結構（均與界面平面正交和橫向分析）在很大程度上取決于成分。闡明了SP-B和SP-C的不同作用，揭示了只有SP-B（表面活性劑中唯一對生命不可或缺的蛋白質）在界面下方的3D膜庫成核。

Kibron LB膜分析儀（及同類型Langmuir槽）在本研究中是不可或缺的基礎工具。它不僅是獲取膜宏觀力學性能（如Π-A等溫線）的主要設備，更是一個多功能平臺，通過與其他技術（橢圓偏振、NR）聯用，實現了對界面膜結構、組成和動態(tài)行為的原位、實時、多尺度分析。該設備的精確控壓能力，為最終通過中子反射技術直接觀察到SP-B特異性的3D儲備庫結構提供了關鍵且可靠的實驗條件，從而有力地支撐了本研究的核心結論。本研究首次通過中子反射等技術在納米尺度上直接證實了SP-B是肺表面活性物質在肺泡界面形成和維持3D膜儲備庫的關鍵“建筑師”，而SP-C則扮演輔助角色。這一發(fā)現從結構生物學的角度深刻揭示了PS維持呼吸力學穩(wěn)定的分子基礎，不僅與SP-B基因缺失致死、而SP-C缺失導致慢性呼吸問題的生理現象相吻合，也為未來開發(fā)治療呼吸窘迫綜合征等肺表面活性物質功能障礙疾病的更優(yōu)仿生制劑提供了關鍵的理論依據和新的設計思路。