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應(yīng)用不同組裝的磷脂酰膽堿對(duì)牛精漿蛋白的隔離：一種新的技術(shù)方法——摘要、介紹
來源：上海謂載 瀏覽 1611 次 發(fā)布時(shí)間:2021-12-20
摘要
精子結(jié)合蛋白（BSP）是牛精漿中的主要蛋白質(zhì)，已知其部分插入精子膜的外小葉，并與其中存在的含膽堿脂質(zhì)結(jié)合。這種插入通過誘導(dǎo)精子早期獲能，對(duì)冷凍保存后的精液質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。BSP蛋白表面性質(zhì)的假設(shè)通過張力測(cè)定法進(jìn)行了驗(yàn)證：BSP蛋白具有高度的表面活性。這表明BSP蛋白不僅通過相互之間的相互作用，而且由于其自身的表面活性，能夠到達(dá)磷脂覆蓋的界面。BSP蛋白插入精子外小葉的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域是在類似Langmuir單分子膜的仿生系統(tǒng)上復(fù)制的。BSP蛋白的插入可以在含有膽堿脂質(zhì)的可壓縮流體域中進(jìn)行。單層膜也被用來研究BSP蛋白與兩種磷脂組裝物的絡(luò)合作用：蛋黃低密度脂蛋白（LDL）或雞蛋磷脂脂質(zhì)體。無論磷脂結(jié)構(gòu)（脂蛋白或脂質(zhì)體）如何，BSP都不能改變膜的結(jié)構(gòu)。只有BSP蛋白與磷脂酰膽堿的總比例是重要的。這兩種螯合劑的區(qū)別在于它們的表面性質(zhì)：LDL有很強(qiáng)的與外層結(jié)合的傾向，而脂質(zhì)體主要以相同的時(shí)間尺度保持在本體中。
介紹
精子結(jié)合蛋白（BSP）是一個(gè)已知在輸卵管精子儲(chǔ)存庫的形成和精子獲能中起作用的蛋白質(zhì)家族，精子成熟是受精的關(guān)鍵步驟[1,2]。在牛精漿中，根據(jù)Manjunath等人的命名法[2]：BSP1[4]、BSP3[5]和BSP5[6,7]分別鑒定和分類了三種比例為10:1:1的主要BSP蛋白[3]。BSP1和BSP3的表觀質(zhì)量為15–16.5 kDa，BSP5的表觀質(zhì)量為28–30 kDa[6,8]。這三種蛋白質(zhì)由一個(gè)獨(dú)特的N端結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)纖維連接蛋白II型結(jié)構(gòu)域組成。只有三種BSP蛋白的N端結(jié)構(gòu)域存在顯著差異[4–6]。每個(gè)纖維連接蛋白II型結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)磷酰膽堿結(jié)合位點(diǎn)[9–14]。最后這些是BSP蛋白的生物學(xué)作用所必需的。事實(shí)上，精子膜的外小葉在射精過程中與含有BSP蛋白的精漿接觸[2,15]。BSP蛋白與精子膜上的含膽堿磷脂（如磷脂酰膽堿和鞘磷脂）快速結(jié)合[9,12,16–19]，并通過部分插入精子質(zhì)膜的外小葉[1,13,20]覆蓋精子表面。這是通向輸卵管精子儲(chǔ)存庫和精子獲能的第一個(gè)關(guān)鍵步驟。BSP蛋白既可溶又能插入疏水膜的事實(shí)證明BSP蛋白具有兩親性。因此，本研究的第一部分旨在通過進(jìn)行張力測(cè)量來檢驗(yàn)這一假設(shè)。
BSP蛋白誘導(dǎo)的早期獲能[21,22]對(duì)冷凍保存后的精液質(zhì)量有負(fù)面影響，因?yàn)樗鼤?huì)導(dǎo)致抗冷性和抗凍性的喪失[12,17,23–25]。因此，保護(hù)器的存在對(duì)維持精子質(zhì)量至關(guān)重要。蛋黃被廣泛用于分離BSP蛋白[17,26–32]。這種隔離是由于蛋黃中存在的低密度脂蛋白（LDL）外層的磷脂酰膽堿與BSP蛋白之間的特異性和強(qiáng)相互作用[9,12,33,34]。在某些情況下，還假設(shè)低密度脂蛋白對(duì)精子早期獲能的保護(hù)作用是由于富含磷脂的低密度脂蛋白極性脂質(zhì)與由于外排而減少的脂質(zhì)和膽固醇的精子膜之間的交換[29]。目前，大豆卵磷脂等其他磷脂被用作蛋黃磷脂的替代品。然而，在這種情況下，脂質(zhì)體和膜之間可能的相互作用尚不清楚。因此，本研究的第二部分旨在比較低密度脂蛋白和脂質(zhì)體與脂膜接觸的行為。為此，在空氣-緩沖液界面上的脂質(zhì)單層被用來模擬精子膜外小葉的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域。這種方法被證明能有效地復(fù)制牛精子膜外小葉脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域的異質(zhì)結(jié)構(gòu)域[35]。最后一種是主要的脂質(zhì)成分，即鞘磷脂、膽固醇、1-棕櫚酰-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿（PC）和血漿鹵素1-（1Z-十八烯基）-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿（P-PC）。在這一單層中，膽固醇和鞘磷脂在34°C溫度下將自身構(gòu)造成濃縮域，周圍是PC和P-PC的液體混合物。LDL和脂質(zhì)體在接近生物膜相關(guān)壓力的情況下引入單層下方的亞相[36]。通過監(jiān)測(cè)表面積的變化來檢測(cè)添加劑與單層膜之間的相互作用。最后，在相同的精子膜外小葉脂質(zhì)模型和相同的條件下，比較了低密度脂蛋白和脂質(zhì)體對(duì)BSP蛋白的螯合特性。