摘要：采用Protamex酶對(duì)玉米谷蛋白進(jìn)行水解，研究不同水解時(shí)間對(duì)玉米谷蛋白的泡沫性質(zhì)、表面張力、理化性質(zhì)、拉曼光譜及靜態(tài)流變學(xué)性質(zhì)等的影響。結(jié)果表明，Protamex酶水解顯著改善玉米谷蛋白的溶解性和泡沫性質(zhì)，在120 min水解物的起泡力最大，是原玉米谷蛋白的2.8倍左右，泡沫穩(wěn)定性表現(xiàn)良好。此時(shí)水解物的表面張力最低、表觀黏度最高，所形成泡沫的微觀形態(tài)細(xì)膩均勻、蛋白膜較厚。隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)，玉米谷蛋白水解物的平均粒徑持續(xù)減小、內(nèi)源熒光強(qiáng)度和表面疏水性逐漸增加，而表面凈電荷呈先減小后增加的變化趨勢(shì)。拉曼光譜分析結(jié)果表明適當(dāng)水解使α-螺旋含量減少、無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角含量增高、酪氨酸殘基峰強(qiáng)比（I850/I830）增強(qiáng)、色氨酸殘基峰強(qiáng)比（I760）降低，但對(duì)β-折疊含量影響較??；長(zhǎng)時(shí)間水解使無(wú)規(guī)卷曲含量顯著增加，酪氨酸殘基峰強(qiáng)比（I850/I830）降低。因此，通過(guò)限制性水解作用可改變玉米谷蛋白的結(jié)構(gòu)及界面性質(zhì)、改善其泡沫性質(zhì)，提高玉米蛋白在食品領(lǐng)域中的潛在利用率。

2021年，全國(guó)玉米產(chǎn)量約27 255萬(wàn)t，玉米加工副產(chǎn)物總量可達(dá)7 000萬(wàn)t左右。玉米蛋白粉（corn gluten meal，CGM）是濕法生產(chǎn)玉米淀粉的主要副產(chǎn)物之一，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%～65%，是一種豐富的植物蛋白質(zhì)資源。玉米蛋白質(zhì)由68%醇溶蛋白、22%谷蛋白及少量白蛋白和球蛋白等組成，水溶性差，不適宜直接在食品行業(yè)中的應(yīng)用，而通常是作為飼料或直接廢棄。玉米谷蛋白主要由谷氨酰胺、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸及結(jié)氨酸等氨基酸組成，酰胺基氨基酸比例較高，是天然表面活性劑的良好來(lái)源。但玉米谷蛋白是由大約20多種分子質(zhì)量在11～127 ku的不同蛋白質(zhì)亞基以二硫鍵為主要相互作用力而緊密連接的巨大、復(fù)雜的大分子蛋白質(zhì)，且僅能溶于稀堿溶液。這導(dǎo)致其很難在食品體系中發(fā)揮起泡或乳化作用。因此，本研究希望通過(guò)適度修飾玉米谷蛋白結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)谷蛋白在氣/水界面吸附的能力，從而改善其起泡性質(zhì)，拓寬玉米谷蛋白在蛋糕、啤酒、冰淇淋以及攪打稀奶油等制品中的應(yīng)用。

已有研究表明物理和化學(xué)方法能夠提高谷蛋白的功能性質(zhì)。Zhao Meng等發(fā)現(xiàn)通過(guò)堿熱處理大米谷蛋白可提升其起泡性及泡沫穩(wěn)定性；Wang Yang等采用低功率密度超聲法對(duì)CGM進(jìn)行改性發(fā)現(xiàn)CGM局部的氨基酸序列相互作用發(fā)生改變，此外，劉金玲和Wang Yaru等分別采用糖基化以及磷酸化等化學(xué)修飾法對(duì)玉米谷蛋白和大米谷蛋白樣品進(jìn)行改性，結(jié)果表明玉米谷蛋白和大米谷蛋白的功能性質(zhì)顯著提高。酶水解法也是蛋白質(zhì)改性的有效方法，具有反應(yīng)條件溫和、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，在食品蛋白質(zhì)深加工中應(yīng)用廣泛。Wang Yonghui等采用Alcalase酶水解CGM并與單寧酸復(fù)合，其混合物的起泡性及氣/水界面行為均顯著優(yōu)于玉米蛋白；Klost等則利用胰蛋白酶對(duì)豌豆分離蛋白進(jìn)行水解，發(fā)現(xiàn)水解可有效提高蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性等功能性質(zhì)并且對(duì)豌豆分離蛋白的界面性質(zhì)也產(chǎn)生了積極的影響。但有報(bào)道稱過(guò)度水解會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)遭到劇烈破壞反而使其功能性質(zhì)降低，由于過(guò)小的肽段會(huì)失去某些形成幾種功能特性所需的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的能力，從而影響其功能性質(zhì)。因此，對(duì)玉米谷蛋白進(jìn)行適度的水解必不可少。Protamex是經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵而制得，屬于內(nèi)切蛋白酶，具有廣泛的酶切位點(diǎn)，使具有緊密空間結(jié)構(gòu)的大分子質(zhì)量玉米谷蛋白的肽鍵斷裂。

本研究在前期研究結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Protamex酶解玉米谷蛋白，以不同酶解時(shí)間表示水解進(jìn)程，探討不同酶解時(shí)間條件下玉米谷蛋白的起泡性、泡沫微觀形態(tài)、表面張力、靜態(tài)流變學(xué)特性、粒徑分布及結(jié)構(gòu)性質(zhì)的變化情況，以期為蛋白酶適度修飾技術(shù)在玉米蛋白質(zhì)上的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)，從而促進(jìn)玉米蛋白質(zhì)的高值化應(yīng)用。

1材料與方法

1.1材料與試劑

CGM購(gòu)自黑龍江龍鳳玉米開發(fā)有限公司，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%（以干基計(jì)算）。

Protamex酶（食品級(jí)）丹麥諾維信公司；α-淀粉酶（食品級(jí)）北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-(phenylamino)naphthylamine-1-sulfonic acid，ANS）美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

T25高速分散機(jī)德國(guó)IKA公司；ZEN3700納米激光粒度電位測(cè)定儀、kinexusPro＋高級(jí)旋轉(zhuǎn)流變儀英國(guó)Malvern公司；BX53F熒光顯微鏡日本奧林巴斯公司；U-2910紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)日本Hitachi公司；RF-6000熒光分光光度計(jì)日本島津公司；MacroRAM拉曼光譜儀堀場(chǎng)（中國(guó)）貿(mào)易有限公司。

1.3方法

1.3.1玉米谷蛋白的制備

先對(duì)CGM進(jìn)行去淀粉、去醇溶蛋白處理，再采用堿提酸沉法提取谷蛋白。去淀粉：CGM分散于pH 6.5水溶液中，料液比1∶10（g/mL），置于65℃恒溫水浴磁力攪拌器中，加入1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的α-淀粉酶反應(yīng)2 h，滅酶15 min后于4 000 r/min離心15 min，所得沉淀用純水洗滌3次，晾干、粉碎。去醇溶蛋白：去淀粉后樣品分散于70%乙醇溶液中，料液比1∶10（g/mL），置于60℃水浴中抽提醇溶蛋白，2 h后于4 000 r/min離心15 min，重復(fù)抽提2次，將沉淀晾干、粉碎。提取谷蛋白：將預(yù)處理后樣品以料液比1∶10分散于0.1 mol/L NaOH溶液，置于60℃恒溫水浴磁力攪拌器中提取2 h，于4 000 r/min離心15 min；取上清液用HCl（4 mol/L）溶液調(diào)節(jié)pH值至等電點(diǎn)，于4 000 r/min離心15 min，將沉淀用70%乙醇溶液和蒸餾水分別洗滌3次，并將pH值調(diào)回至7.0，將所得谷蛋白冷凍干燥、粉碎后過(guò)80目篩備用。

1.3.2 Protamex酶水解玉米谷蛋白

將1.3.1節(jié)所得玉米谷蛋白分散于蒸餾水中，底物質(zhì)量濃度5 g/100 mL，按酶與底物之比0.81%加入Protamex酶，在pH 7.0、60℃條件下進(jìn)行水解，期間以0.1 mol/L NaOH溶液維持pH值恒定，并采用pH-stat法測(cè)定水解度。水解反應(yīng)分別進(jìn)行10、30、60、120 min和150 min后，煮沸30 min滅酶，水解液于4 500 r/min離心15 min，所得上清液冷凍干燥后為水解物，待測(cè)。

1.3.3溶解性的測(cè)定

將2 mL離心管標(biāo)記、稱量記為m1，稱取樣品0.1 g置于離心管中，再向離心管中加入1 mL的蒸餾水，旋渦振蕩10 min，后10 000 r/min離心10 min，棄去上清液，將沉淀物于80℃干燥8 h，最后將帶有沉淀物的離心管稱量記為m2。按照式（1）計(jì)算：

1.3.4泡沫性質(zhì)的測(cè)定

樣品分散于蒸餾水中制成質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的蛋白溶液。取20 mL樣品溶液放置于50 mL燒杯中，記錄初始高度（H0），以13 500 r/min高速間歇攪打2 min，立刻記錄此時(shí)泡沫高度H1，室溫下靜置30 min后的記錄泡沫高度H2。起泡性和泡沫穩(wěn)定性按照式（2）、（3）計(jì)算：

1.3.5泡沫宏觀和微觀形態(tài)觀察

按照1.3.4節(jié)方法將樣品溶液攪打起泡，用相機(jī)拍照記錄泡沫產(chǎn)生0、10、20 min和30 min的宏觀形態(tài)變化。同時(shí)取部分泡沫置于載玻片上，并于顯微鏡下觀察并記錄相應(yīng)的微觀形態(tài)變化。

1.3.6表面張力的測(cè)定

將樣品配制為質(zhì)量濃度1 g/100 mL的分散液，采用芬蘭Kibron公司生產(chǎn)的Delta-8全自動(dòng)高通量表面張力儀按照GB/T 27842—2011《化學(xué)品動(dòng)態(tài)表面張力的測(cè)定快速氣泡法》的方法測(cè)定其表面張力。

1.3.7粒徑及Zeta電位的測(cè)定

將樣品制為質(zhì)量濃度1 mg/mL分散液并過(guò)0.22μm水系膜，設(shè)置溫度為25℃，蛋白折射率1.46，吸收參數(shù)1.33，溶劑為水，采用馬爾文納米激光粒度電位測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.8內(nèi)源熒光光譜的測(cè)定

將樣品制為質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的分散液，室溫下通過(guò)熒光分光光度計(jì)掃描其內(nèi)源熒光強(qiáng)度。設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍300～400 nm，狹縫寬度5 nm。

1.3.9表面疏水性的測(cè)定

將樣品溶解并稀釋至蛋白質(zhì)量濃度0.01～0.20 mg/mL之間。取5 mL樣品溶液加入25μL ANS試劑（濃度為8 mmol/L，溶于0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液）在室溫條件下反應(yīng)15 min。設(shè)定熒光分光光度計(jì)的激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為470 nm，狹縫5 nm，分別測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度（FI0）和樣品加入ANS試劑后的熒光強(qiáng)度（FI1），F(xiàn)I1和FI0的差值記為FI，以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)I為縱坐標(biāo)作圖，曲線初始斜率即為樣品的表面疏水性指數(shù)。

1.3.10拉曼光譜的測(cè)定

將樣品平鋪在載玻片上進(jìn)行拉曼光譜的測(cè)定，設(shè)置波長(zhǎng)532 nm，掃描范圍400～2 000 cm-1，掃描10次，每個(gè)樣品3次累加，以苯丙氨酸（1 003±1）cm-1的譜峰強(qiáng)度作為歸一化因子并運(yùn)用LabSpec6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.3.11靜態(tài)流變學(xué)的測(cè)定

樣品制為質(zhì)量濃度為10 mg/mL的分散液，將樣品分散液緩慢傾注于于高級(jí)旋轉(zhuǎn)流變儀的樣品臺(tái)上。設(shè)定剪切速率為0.1～100 s-1，測(cè)試夾具為60 mm的錐板。將表觀黏度與剪切速率按照式（4）的冪律方程進(jìn)行擬合：

式中：η為黏度/（Pa·s）；K為黏稠系數(shù)/（Pa·sn）；ε為剪切速率/s-1；n為流動(dòng)指數(shù)。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，結(jié)果用表示，采用SPSS Statistics 17.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著，采用OriginPro 2019b軟件作圖。