海南大學(xué)Jingrong Ma課題組為了更好地了解椰子球蛋白（CG）在不同pH下的乳化機(jī)制，研究了不同pH（3-11）未加熱和加熱（90℃，30 min）條件下的界面行為與乳液穩(wěn)定性（O/W）之間的關(guān)系。CG的動(dòng)態(tài)界面張力在pH為11時(shí)最低，其次是pH為9、3、7和5。CG在pH值為5時(shí)界面吸附效果最好，但在pH值為11時(shí)界面出現(xiàn)解吸情況。各組在加熱后吸附量均下降。pH為5時(shí)的CG具有最高的擴(kuò)張彈性模量（Ed），其次是pH為3、7、9和11。加熱CG的Ed趨勢與未加熱樣品一致，但明顯降低。在高頻和振幅擾動(dòng)下，pH為11處的CG具有較高的膨脹模量(E)。CG表現(xiàn)出更好的界面行為，有助于提高pH 3時(shí)的乳液穩(wěn)定性。闡明界面行為與乳化液穩(wěn)定性的關(guān)系對促進(jìn)CG作為乳化劑的應(yīng)用具有重要意義。

動(dòng)態(tài)界面張力測量方法

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1.儀器與試劑

儀器：Kibron界面張力儀（含Wilhelmy板或Du Noüy環(huán)、恒溫水浴模塊、自動(dòng)進(jìn)樣器）、pH計(jì)（精度±0.01）、電子天平（稱量蛋白）、磁力攪拌器、離心機(jī)（可選）、移液槍（1-1000μL）、燒杯/樣品池（潔凈無污染）。

試劑：椰子球蛋白（純度≥90%，建議分子量10-50 kDa）、超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）、緩沖溶液（如PBS緩沖液，pH范圍5.0-9.0，離子強(qiáng)度0.01-0.1 M，避免干擾蛋白質(zhì)吸附）、稀鹽酸/氫氧化鈉（調(diào)節(jié)pH）。

二、操作步驟

步驟1：儀器預(yù)熱與校準(zhǔn)

開機(jī)：連接電源，打開Kibron界面張力儀主機(jī)及軟件（如DeltaFlow或Kibron Control），啟動(dòng)恒溫水浴模塊（設(shè)置目標(biāo)溫度，通常25±0.1℃，界面張力受溫度影響顯著）。

校準(zhǔn)：

Wilhelmy板法：使用標(biāo)準(zhǔn)液體（如超純水，25℃時(shí)γ≈72 mN/m）校準(zhǔn)。將潔凈的Wilhelmy板（鉑片，尺寸約10×20 mm，邊緣垂直）安裝到傳感器上，確保板面無劃痕、無油脂（可用乙醇擦拭后灼燒冷卻）。在軟件中輸入標(biāo)準(zhǔn)液體的表面張力值，儀器自動(dòng)校準(zhǔn)位移傳感器與力的關(guān)系。

Du Noüy環(huán)法（若使用）：校準(zhǔn)環(huán)的周長（需測量環(huán)的內(nèi)外徑，計(jì)算平均周長），并用已知表面張力的液體驗(yàn)證準(zhǔn)確性。

步驟2：椰子球蛋白樣品制備

溶解：稱取一定量椰子球蛋白（如10 mg），加入5-10 mL對應(yīng)pH的緩沖液（如pH 7.0的PBS），磁力攪拌（300 rpm）或漩渦振蕩15-30 min，至完全溶解（避免劇烈攪拌產(chǎn)生氣泡）。

pH調(diào)節(jié)：用1 M HCl或NaOH溶液逐滴調(diào)節(jié)蛋白溶液pH至目標(biāo)值（如pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），每次調(diào)節(jié)后靜置2 min，用校準(zhǔn)過的pH計(jì)測量確認(rèn)（插入深度≥1 cm，避免界面干擾）。

脫氣（可選）：若溶液含溶解氣體（如空氣），可將樣品置于真空干燥器中10-15 min，減少界面氣泡（氣泡會導(dǎo)致界面張力測量值偏高）。

步驟3：界面張力測量

安裝樣品池：將清潔的樣品池（玻璃或聚四氟乙烯材質(zhì)，內(nèi)徑≥50 mm）置于儀器樣品臺上，用移液槍注入20-30 mL待測蛋白溶液（液面高度需覆蓋Wilhelmy板浸入深度，通?！?0 mm）。

安裝Wilhelmy板：手動(dòng)或自動(dòng)將Wilhelmy板緩慢浸入樣品池，確保板面與液面垂直，且邊緣剛好接觸液面（軟件提示“板接觸液面”后停止）。

平衡等待：啟動(dòng)測量程序，儀器自動(dòng)記錄界面張力隨時(shí)間的變化。蛋白質(zhì)需在界面上吸附達(dá)到平衡（通常5-30 min，具體時(shí)間需預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，觀察數(shù)據(jù)趨于穩(wěn)定后停止）。

數(shù)據(jù)采集：平衡后，軟件自動(dòng)記錄穩(wěn)定的界面張力值（γ），每個(gè)pH條件重復(fù)測量3次（更換新鮮樣品），取平均值。

步驟4：清洗與切換樣品

測量完一個(gè)pH樣品后，用去離子水或下一個(gè)pH緩沖液沖洗樣品池和Wilhelmy板3次（避免交叉污染）。

若板面有殘留蛋白，可用軟毛刷輕刷鉑片（避免刮傷），再用乙醇擦拭后灼燒（僅適用于耐高溫鉑片）。

三、注意事項(xiàng)

1.pH調(diào)節(jié)的關(guān)鍵控制

蛋白質(zhì)的界面張力對pH敏感（尤其接近等電點(diǎn)pI時(shí)，電荷減少，疏水性增強(qiáng)），需精確調(diào)節(jié)pH（建議使用微量移液槍逐滴添加，并充分混勻）。

避免pH調(diào)節(jié)劑過量（如HCl/NaOH濃度過高可能破壞蛋白質(zhì)構(gòu)象），推薦使用0.1 M緩沖液儲備液稀釋至目標(biāo)離子強(qiáng)度（如0.01 M）。

2.蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性

椰子球蛋白在極端pH（如pH＜5或＞9）可能變性沉淀，需通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定其穩(wěn)定pH范圍（通常接近生理pH 5-7）。若出現(xiàn)沉淀，需離心（10,000×g，10 min）去除，取上清測量（沉淀可能干擾界面吸附）。

蛋白質(zhì)濃度需適宜（建議0.1-1 mg/mL）：濃度過低時(shí)界面吸附量不足，界面張力偏高；過高可能導(dǎo)致界面膜過厚，吸附動(dòng)力學(xué)復(fù)雜。

3.儀器清潔與污染防控

Wilhelmy板需保持絕對潔凈（任何油脂或灰塵會導(dǎo)致界面張力測量值偏差），使用前可用鉻酸洗液浸泡（10%H?CrO?）10 min，再用超純水沖洗并干燥。

樣品池每次使用后需用去離子水沖洗，避免殘留鹽類或蛋白質(zhì)吸附（尤其高離子強(qiáng)度緩沖液易在池壁結(jié)垢）。

4.溫度與界面穩(wěn)定

界面張力隨溫度升高顯著降低（約每℃下降0.1-0.2 mN/m），需使用恒溫水浴嚴(yán)格控制溫度（誤差±0.1℃），并在測量時(shí)等待樣品與儀器溫度平衡（約5 min）。

避免環(huán)境溫度波動(dòng)（如空調(diào)風(fēng)直吹），可在儀器周圍放置隔熱罩。

5.數(shù)據(jù)可靠性驗(yàn)證

每次測量前檢查Wilhelmy板的濕潤性（浸入純水后應(yīng)能自動(dòng)吸附，無氣泡附著）。若板面疏水，可用稀表面活性劑（如0.01%SDS）浸泡清洗（僅限玻璃板，鉑片禁用）。

預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蛋白質(zhì)在界面的吸附行為：通過動(dòng)態(tài)界面張力曲線（γ-t）判斷是否達(dá)到平衡（斜率趨近于0），若長時(shí)間不穩(wěn)定（如持續(xù)下降），可能是蛋白質(zhì)未完全溶解或溶液中有雜質(zhì)。

結(jié)果

Kdiff、Kp和Kr的最高值分別為pH值7、3和5。柔性蛋白可以在油水界面上更快地吸附和重新排列。pH為3時(shí)CG靈活的二級結(jié)構(gòu)，使其具有更好的吸附動(dòng)力學(xué)，。pH 5（接近pI 4.3）的CG更弱的靜電斥力，引起了更好的結(jié)構(gòu)重排。加熱后，除pH值為5時(shí)CG的Kdiff外，所有樣品的Kdiff、Kp和Kr均有所下降。加熱后的CG具有較低的初始界面張力和較短的平衡吸附時(shí)間（圖1a），它能迅速達(dá)到平衡狀態(tài)，并且吸附動(dòng)力學(xué)指數(shù)較低。此外，加熱后的CG表現(xiàn)出顯著的變性和聚集，殘留的蛋白質(zhì)分子會產(chǎn)生空間位阻，從而阻礙聚集后的CG到達(dá)油水界面。此外，不溶性CG聚集體對殘留CG分子的吸附產(chǎn)生了屏障。CG在pH為5時(shí)，蛋白質(zhì)形成大量沉淀，溶解度僅為12.05%?？扇苄缘鞍缀康鸵馕吨^弱的靜電排斥力，這使剩余的蛋白更容易擴(kuò)散，從而導(dǎo)致最高的Kdiff。與動(dòng)態(tài)界面張力相比，CG與pH 5T的吸附動(dòng)力學(xué)不受蛋白質(zhì)濃度的影響。