1材料與方法

1.1材料

試驗菌株BD-2是以原油為唯一碳源從新疆克拉瑪依石油污染土壤中分離的降解菌。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5 g，酵母粉3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，調pH至7.0。

1.2方法

1.2.1生物表面活性劑的提取

將菌株BD-2的發(fā)酵液于10 000 r/min，4℃離心20 min去除菌體，上清液用HCl調pH為2.0，4℃靜置12 h，10 000 r/min，4℃離心30 min收集沉淀，將離心收集的沉淀溶解于無菌去離子水中，用氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至7.0，冷凍干燥獲得生物表面活性劑粗品。

1.2.2生物表面活性劑的表面活性測試

將菌株BD-2的發(fā)酵液于10 000 r/min，4℃條件下進行20 min的離心處理去除菌體，取一定量的發(fā)酵上清液進行排油圈、表面張力和乳化指數(shù)(E24)的測定，每個處理重復3次。

1.2.3發(fā)酵時間對菌株BD-2產表面活性劑的影響

將菌株BD-2制備成菌懸液，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃，120 r/min培養(yǎng)，每12 h測定其菌落數(shù)、表面活性劑量和表面張力，每個處理重復3次。

1.2.4培養(yǎng)基的優(yōu)化

（1）碳、氮源影響。將1%的菌株BD-2菌懸液接種到含3%各種碳源（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、原油、礦物油）的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃，120 r/min培養(yǎng)24 h，每個處理重復3次，測定表面活性劑量和表面張力，確定最適碳源。以尿素、氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉、硫酸銨作為氮源，將1%的菌株BD-2菌懸液接種到含各種氮源（0.15%）的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃，120 r/min培養(yǎng)24 h，每個處理重復3次，測定表面活性劑量和表面張力，確定最適氮源。

（2）金屬離子的影響。向優(yōu)化后的碳氮源種子培養(yǎng)基中分別加入硫酸錳和硫酸亞鐵，使培養(yǎng)基中Mn2+和Fe2+的濃度分別為0、0.2、0.5、1和2 g/L，于120 r/min，30℃培養(yǎng)24 h，每個處理重復3次，測定表面活性劑量和表面張力。

1.2.5發(fā)酵條件的優(yōu)化

在最佳碳源和氮源的基礎上，將1%的菌株BD-2的菌懸液，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，分別調節(jié)初始pH（5~9），溫度（10~40℃）和鹽濃度（0%~7%），每個處理重復3次，通過測定表面活性劑量和發(fā)酵液表面張力，進一步優(yōu)化發(fā)酵過程的環(huán)境條件。

1.2.6生物表面活性劑穩(wěn)定性研究

在優(yōu)化發(fā)酵條件下，將菌株培養(yǎng)24 h，去除發(fā)酵液中的菌體，分別調節(jié)上清液pH（3~12），溫度（10~100℃），鹽度（0%~20%），靜置2 h后，通過測定發(fā)酵液表面張力和萘的溶解度評價表面活性劑的穩(wěn)定性，每個處理重復3次。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析以及顯著性檢驗，利用Origin 2021作圖。